Metode HPLC dan GC

BAB I

PENDAHULUAN

1.1              Tujuan Percobaan Praktikum

            Pemisahan senyawa dengan metode Hight Performance Liquid Chromatografy.

1.2              Prinsip Percobaan:

HPLC menggunakan kolom yang mengandung partikel – partikel kecil – kecil dari fase tetap dan karena luas permukaan yang lebih besar dari fase tetap maka sampel dalam HPLC terpisah dengan sangat baik dengan efisiensi yang tinggi. Mekanisme pemisahan yang berbeda dengan cepat dilakukan mengikatkan gugus – gugus kimia yang berbeda pada permukaan partikel silica yang disebut fase terikat. Secara teoritis HPLC itu identik dengan Liquid Solid Chromatografy dan ion exchange Chromatografy.

1.3       Landasan Teori

1.3.1    Penentuan Kadar Glukosa Dan Fruktosa Pada Madu Randu    dan Madu Kelengkeng Dengan Metode Kromatografi Cair Kinerja Tinggi

Pendahuluan

Glukosa yang terdapat di dalam madu berguna untuk memperlancar kerja jantung dan dapat meringankan gangguan penyakit hati (lever). Glukosa dapat diubah menjadi glikogen yang sangat berguna untuk membantu kerja hati dalam menyaring racun-racun dari zat yang sering merugikan tubuh. Selain itu, glukosa merupakan sumber energi untuk seluruh system jaringan otot. Sedangkan, fruktosa disimpan sebagai cadangan dalam hati untuk digunakan bila tubuh membutuhkan dan juga untuk mengurangi kerusakan hati. Fruktosa dapat dikonsumsi oleh para penderita diabetes karena transportasi fruktosa ke sel-sel tubuh tidak membutuhkan insulin, sehingga tidak mempengaruhi keluarnya insulin. Di samping itu, kelebihan fruktosa adalah memiliki kemanisan 2,5 kali dari glukosa.

Penentuan gula pereduksi selama ini dilakukan dengan metode pengukuran konvensional seperti metode osmometri, polarimetri, dan refraktometri maupun berdasarkan reaksi gugus fungsional dari senyawa sakarida tersebut (seperti metode Luff- Schorl, Seliwanoff, Nelson-Somogyi dan lainlain). Hasil analisisnya adalah kadar gula pereduksi total dan tidak dapat menentukan gula pereduksi secara individual. Untuk menganalisis kadar masing-masing dari gula pereduksi penyusun madu dapat dilakukan dengan menggunakan metode Kromatografi Cair Kinerja Tinggi (KCKT). Metode ini mempunyai beberapa keuntungan antara lain dapat digunakan pada senyawa dengan bobot molekul besar dan dapat dipakai untuk senyawa yang tidak tahan panas.

Penentuan kadar glukosa dan fruktosa dengan kromatografi ini juga harus mempertimbangkan berbagai hal antara lain pemilihan detektor, kolom, pemilihan eluen, laju alir eluen serta suhu kolom. Ini disebabkan karena hal-hal tersebut dapat mempengaruhi resolusi dari tiap-tiap komponen. Bila dua puncak kromatogram dari dua komponen terpisah sempurna maka dikatakan resolusi dua komponen tersebut sempurna. Pemisahan masing-masing komponen dengan menggunakan alat KCKT harus dilakukan pada kondisi optimum. Pemisahan yang baik adalah bila kromatogram masing-masing komponen tidak saling tumpang tindih.

Materi Dan Metode

Bahan

Bahan-bahan yang digunakan dalam  penelitian ini antara lain : air deionisasi, larutan standar glukosa 5 % dan larutan standar fruktosa 5 %. Sampel penelitian adalah madu randu dan madu kelengkeng yang telah memenuhi standar SII dari merk yang sama. Tiap jenis madu digunakan dua buah sampel dan tiap sampel dilakukan pengukuran sebanyak dua kali.

Peralatan

Alat-alat yang digunakan dalam penelitian ini antara lain: Seperangkat alat KCKT (buatan ICI Instruments) yang dilengkapi dengan detektor indeks bias (Shodex RI SE-61) serta integrator merek Shimadzu CR6A Chromatopac; labu ukur 20 mL, 25 mL, 50 mL, pipet volume 1,0 mL, 2,5 mL, 5 mL, 10 mL, 25 mL, 2,5 mL, alat sentrifugasi, kertas saring 0,45 μm.

Cara Kerja

Pembuatan Larutan Standar

Larutan standar glukosa dan fruktosa dibuat dengan konsentrasi masing-masing 5% b/v. Adapun cara pembuatannya adalah sebagai berikut :

a.       Masing-masing senyawa (glukosa dan fruktosa) ditimbang sebanyak 1 g.

b.      Senyawa-senyawa tersebut dimasukkan ke dalam labu ukur 20 mL, kemudian ditambah aquades sampai tanda batas (kadar glukosa dan fruktosa masing-masing 5 % b/v).

Penentuan Kondisi KCKT untuk Pemisahan Glukosa dan Fruktosa

Kondisi analisis untuk penentuan kandungan glukosa dan fruktosa pada sampel madu adalah pada kondisi pemisahan yang terbaik. Kondisi tersebut tercapai jika hasil kromatogram masing-masing komponen tidak tumpang tindih satu dengan yang lain. Kromatogram yang tidak tumpang tindih tersebut salah satunya dapat dicapai dengan mengatur suhu kolom dan laju alir dari eluen. Kondisi pemisahan dapat ditentukan pada saat pengukuran larutan standar, di mana eluen yang digunakan adalah air deionisasi pada kolom metacarb 87C dan dideteksi dengan menggunakan detektor indeks bias.

Pembuatan Kurva Standar

Larutan standar glukosa dan fruktosa 0,125 % diinjeksikan sebanyak 20 μL dengan menggunakan auto syringe injector. Biarkan sampai semua komponen keluar dan terpisah dari kolom. Waktu retensi untuk masing-masing komponen (glukosa dan fruktosa) dicatat. Langkah tersebut diulangi dengan menginjeksikan 20 μL larutan standar glukosa dan fruktosa 0,25 % kemudian dengan larutan standar 0,5 % dan 1 %. Plot hubungan antara konsentrasi larutan standar dengan luas puncak dari masing-masing komponen.

Hasil Dan Pembahasan

Kromatografi Campuran Senyawa Standar

Penentuan Kondisi KCKT untuk Pemisahan Glukosa dan Fruktosa

Pembuatan Kurva Standar

Kurva Standart Glukosa

Kurva Standart Fruktosa

Analisis Kuantitatif (Kadar Glukosa dan Fruktosa)

Simpulan Dan Saran

Simpulan

Berdasarkan hasil penelitian dan pembahasan yang telah dilakukan, maka dapat disimpulkan sebagai berikut :

1.      Pemisahan dan analisis kadar glukosa dan fruktosa pada madu randu dan madu kelengkeng dapat dilakukan menggunakan teknik KCKT. Kolom yang digunakan adalah kolom metacarb 87C dengan eluen air deionisasi. Kondisi operasional yang terbaik diperoleh pada suhu kolom 80ºC dan laju alir 1 mL/menit dengan menggunakan detektor indeks bias.

2.      Kadar glukosa pada madu randu adalah sebesar 27,31 % dan pada madu kelengkeng sebesar 28,09 %. Sedangkan kadar fruktosa pada madu randu sebesar 40,99 % dan pada madu kelengkeng sebesar 40,03 %.

3.      Kadar glukosa dan fruktosa dari tiap-tiap sampel madu telah memenuhi syarat mutu madu nasional (SII) dimana kadar gula pereduksi total pada madu randu sebesar 68,12 % dan pada madu kelengkeng sebesar 68,12 %.

Saran

1.      Perlu dilakukan penelitian lebih lanjut tentang kandungan senyawa sakarida lain selain glukosa dan fruktosa dalam madu seperti sukrosa, maltosa,dan laktosa.

2.      Perlu dilakukan penelitian mengenai syarat mutu madu selain glukosa dan fruktosa untuk menentukan kualitas madu seperti enzim, dan kadar dekstrin.

1.3.2    Kromatography

Kromatografi adalah suatu istilah umum yang digunakan untuk bermacam-macam teknik pemisahan yang didasarkan atas partisi sampel diantara suatu rasa gerak yang bisa berupa gas ataupun cair dan rasa diam yang juga bisa berupa cairan ataupun suatu padatan. Penemu Kromatografi adalah Tswett yang pada tahun 1903, mencoba memisahkan pigmen-pigmen dari daun dengan menggunakan suatu kolom yang berisi kapur (CaSO₄). lstilah kromatografi diciptakan oleh Tswett untuk melukiskan daerah-daerah yang berwarna yang bergerak kebawah kolom. Pada waktu yang hampir bersamaan, D.T. Day juga menggunakan kromatografi untuk memisahkan fraksi-fraksi petroleum, namun Tswett lah yang pertama diakui sebagai penemu dan yang menjelaskan tentang proses kromatografi.

Penyelidikan tentang kromatografi kendor untuk beberapa tahun sampai digunakan suatu teknik dalam bentuk kromatografi padatan cair (LSC). Kemudian pada akhir tahun 1930 an dan permulaan tahun 1940 an, kromatografi mulai berkembang. Dasar kromatografi lapisan tipis (TLC) diletakkan pada tahun 1938 oleh Izmailov dan Schreiber, dan kemudian diperhalus oleh Stahl pada tahun 1958. Hasil karya yang baik sekali dari Martin dan Synge pada tahun 1941 (untuk ini mereka memenangkan Nobel) tidak hanya mengubah dengan cepat kroinatografi cair tetapi seperangkat umum langkah untuk pengembangan kromatografi gas dan kromatografi kertas. Pada tahun 1952 Martin dan James mempublikasikan makalah pertama mengenai kromatografi gas. Diantara tahun 1952 dan akhir tahun 1960 an kromatografi gas dikembangkan menjadi suatu teknik analisis yang canggih.

 Kromatografi Cair Kinerja Tinggi (KCKT) atau High Pressure Liquid Chromatography (HPLC) merupakan salah satu metode kimia dan fisikokimia. KCKT termasuk metode analisis terbaru yaitu suatu teknik kromatografi dengan fasa gerak cairan dan fasa diam cairan atau padat. Banyak kelebihan metode ini jika dibandingkan dengan metode lainnya (Done dkk, 1974; Snyder dan Kirkland, 1979; Hamilton dan Sewell, 1982; Johnson dan Stevenson, 1978). Kelebihan itu antara lain:

a.       mampu memisahkan molekul-molekul dari suatu campuran

b.      mudah melaksanakannya

c.       kecepatan analisis dan kepekaan yang tinggi

d.      dapat dihindari terjadinya dekomposisi / kerusakan bahan yang dianalisis

e.       Resolusi yang baik

f.       dapat digunakan bermacam-macam detektor

g.      Kolom dapat digunakan kembali

h.      mudah melakukan "sample recovery"

Kromatografi cair, dalam praktek ditampilkan dalam kolom gelas berdiameter besar, pada dasamya dibawah kondisi atmosfer. Waktu analisis lama dan segala prosedur biasanya sangat membosankan. Pada akhir tahun 1960 an, semakin banyak usaha dilakukan untuk pengembangan kromatografi cair sebagai suatu teknik mengimbangi kromatografi gas. High Performance Liquid Chromatography (HPLC) atau Kromatografi Cair Penampilan Tinggi atau High Preformance = Tekanan atau Kinerja Tinggi, High Speed = Kecepatan Tinggi dan Modern = moderen) telah berhasil dikembangkan dari usaha ini. Kemajuan dalam keduanya instrumentasi dan pengepakan kolom terjadi dengan cepatnya sehingga sulit untuk mempertahankan suatu bentuk hasil keahlian membuat instrumentasi dan pengepakan kolom dalam keadaan tertentu. Tentu saja, saat ini dengan teknik yang sudah matang dan dengan cepat KCKT mencapai suatu keadaan yang sederajat dengan kromatografi gas.

1.3.3    Jenis-jenis Kromatography

A.    Kromatografi padatan cair (LSC)

      Teknik ini tergantung pada teradsorpsinya zat padat pada adsorben yang polar seperti silika gel atau alumina. Kromatografi lapisan tipis (TLC) adalah salah satu bentuk dari LSC. Dalam KCKT kolom dipadati atau dipak dengan partikel-partikel micro or macro particulate or pellicular (berkulit tipis 37 -44 μ).Sebagian besar dari KCKT sekarang ini dibuat untuk mencapai partikel-partikel microparticulate lebih kecil dari 20μ . Teknik ini biasanya digunakan untuk zat padat yang mudah larut dalam pelarut organik dan tidak terionisasi. Teknik ini terutama sangat kuat untuk pemisahan isomer-isomer.

B.     Kromatografi partisi

Teknik ini tergantung pada partisi zat padat diantara dua pelarut yang tidak dapat bercampur salah satu diantaranya bertindak sebagai rasa diam dan yang lainnya sebagai fasa gerak. Pada keadaan awal dari kromatografi cair (LSC), rasa diamnya dibuat dengan cara yang sama seperti pendukung pada kromatografi gas (GC). Fasa diam (polar atau nonpolar) dilapisi pada suatu pendukung inert dan dipak kedalam sebuah kolom. Kemudian rasa gerak dilewatkan melalui kolom. Bentuk kromatografi partisi ini disebut kromatografi cair cair (LLC). Untuk memenuhi kebutuhan akan kolom-kolom yang dapat lebih tahan lama, telah dikembangkan pengepakan fase diam yang berikatan secara kimia dengan pendukung inert. Bentuk kromatografi partisi ini disebut kromatografi fase terikat (BPC = Bonded Phase Chromatography). BPC dengan cepat menjadi salah satu bentuk yang paling populer dari KCKT. Kromatografi partisi (LLC dan BPC), disebut "fase normal" bila fase diam lebih polar dari fase gerak dan "fase terbalik" bila fase gerak lebih polar dari pada fase diam.

C.    Kromatografi penukar ion (IEC)

Teknik ini tergantung pada penukaran (adsorpsi) ion-ion di antara fase gerak dan tempat-tempat berion dari pengepak. Kebanyakan mesin-mesin berasal dari kopolimer divinilbenzen stiren dimana gugus-gugus fungsinya telah ditambah. Asam sulfonat dan amin kuarterner merupakan jenis resin pilihan paling baik untuk digunakan Keduanya, fase terikat dan resin telah digunakan. Teknik ini digunakan secara luas dalam life sciences dan dikenal untuk pemisahan asam-asam amino, teknik ini dapat dipakai untuk keduanya kation dan anion.

D.    Kromatografi eksklusi

Teknik ini unik karena dalam pemisahan didasarkan pada ukuran molekul dari zat padat. Pengepak adalah suatu gel dengan permukaan berlubang-lubang sangat kecil (porous) yang inert. Molekul-rnolekul kecil dapat masuk dalarn jaringan dan ditahan dalam fase gerak yang menggenang (stagnat mobile phase). Molekul- molekul yang lebih besar, tidak dapat masuk kedalam jaringan dan lewat melalui kolom tanpa ditahan. Kromatografi eksklusi rnernpunyai banyak nama, yang paling umum disebut permeasi gel (GPC) dan filtrasi gel. Apapun namanya, mekanismenya tetap sama. Dalam bidang biologi, Sephadex, suatu Cross-linked dextran gel, telah digunakan secara luas, hanya pengepak keras dan semi keras (polistiren, silika, glass) yang digunakan dalam KCKT. Dextran gel lunak tidak dapat menahan kinerja diatas 1 atau 2 atmosfer. Tenik ini dikembangkan untuk analisis polimer-polimer dan bahan-bahan biologi, terutama digunakan untuk rnolekul-molekul kecil.

E.     Kromatografi pasangan ion (IPC)

Kromatogtafi pasangan ion sebagai penyesuaian terhadap KCKT termasuk baru, pemakaian pertama sekali pada pertengahan tahun 1970. Diterimanya IPC sebagai metode baru KCKT merupakan hasil kerja Schill dan kawan-kawan dan dari beberapa keuntungan yang unik. Kadang-kadang IPC disebut juga kromatografi ekstraksi, kromatografi dengan suatu cairan penukar ion dan paired ion chromatography (PIC). Setiap teknik-teknik ini mempunyai dasar yang sama.

Popularitas IPC muncul terutama sekali dari keterbatasan IEC dan dari sukanya menangani sampel-sampel tertentu dengan metode-metode LC lainnya (seperti senyawa yang sangat polar, senyawa yang terionisasi secara kompleks dan senyawa basa kuat).

IPC dapat dilaksanakan dalam dua tipe yaitu fase normal dan fase balik. Fase diam dari rase balik IPC dapat terdiri dari suatu pengepak silika yang disilanisasi (misalnya C8 atau C18 Bonded Phase) atau dari suatu pengepak yang diperoleh secara mekanik, fase organik yang tidak dapat bercampur dengan air seperti 1 pentanol. Fase diam yang dipakai adalah Cs atau CIS BPC Packing. Fase gerak terdiri dari suatu larutan bufer (ditambah suatu kosolven organik seperti metanol atau asetonitril untuk pemisahan fase terikat) dan suatu penambahan ion tanding,yang muatannya berlawanan dengan molekul sampel.

Sebagai contoh, untuk pemisahan suatu kelompok asam-asam karboksilat menggunakan suatu fase gerak yang dibufer pada pH 7,0 supaya semua senyawa- senyawa sampel berada dalam bentuk RCOO (dilambangkan dengan R). Ion tanding dalam hal ini bisa berupa tetrabutyl ammonium ion, BU₄N+ (atau TBA⁺).Dalam hal yang paling sederhana dari IPC, dapat dianggap bahwa sampel dan ion tanding dapat lama hanya dalam fase gerak air, dan pasangan ion yang dibentuk dari ion-ion ini dapat larut hanya dalam fase diam organik

1.3.4    HPLC

Kolom dan pelarut Membingungkan, ada dua perbedaan dalam HPLC, yang mana tergantung   pada polaritas relatif dari pelarut dan fase diam. Fase normal HPLC Ini secara esensial sama dengan apa yang sudah anda baca tentang kromatografi lapis tipis atau kromatografi kolom. Meskipun disebut sebagai âœnormalâ, ini bukan merupakan bentuk yang biasa dari HPLC. Kolom diisi dengan partikel silika yang sangat kecil dan pelarut non polar misalnya heksan. Sebuah kolom sederhana memiliki diameter internal 4.6 mm (dan mungkin kurang dari nilai ini) dengan panjang 150 sampai 250 mm.Senyawa-senyawa polar dalam campuran melalui kolom akan melekat lebih lama pada silika yang polar dibanding degan senyawa-senyawa non polar. Oleh karena itu, senyawa yang non polar kemudian akan lebih cepat melewati kolom.

Fase balik HPLC Dalam kasus ini, ukuran kolom sama, tetapi silika dimodifikasi menjadi non polar melalui pelekatan rantai-rantai hidrokarbon panjang pada permukaannya secara sederhana baik berupa atom karbon 8 atau 18. Sebagai contoh, pelarut polar digunakan berupa campuran air dan alkohol seperti metanol. Dalam kasus ini, akan terdapat atraksi yang kuat antara pelarut polar dan molekul polar dalam campuran yang melalui kolom. Atraksi yang terjadi tidak akan sekuat atraksi antara rantai-rantai hidrokarbon yang berlekatan pada silika (fase diam) dan molekul-molekul polar dalam larutan.

Oleh karena itu, molekul-molekul polar dalam campuran akan menghabiskan waktunya untuk bergerak bersama dengan pelarut.Senyawa-senyawa non polar dalam campuran akan cenderung membentuk atraksi dengan gugus hidrokarbon karena adanya dispersi gaya van der Waals. Senyawa-senyawa ini juga akan kurang larut dalam pelarut karena membutuhkan pemutusan ikatan hydrogen sebagaimana halnya senyawa-senyawa tersebut berada dalam molekul-molekul air atau metanol misalnya. Oleh karenanya, senyawa-senyawa ini akan menghabiskan waktu dalam larutan dan akan bergerak lambat dalam kolom.Ini berarti bahwa molekul-molekul polar akan bergerak lebih cepat melalui kolom. Fase balik HPLC adalah bentuk yang biasa digunakan dalam HPLC. Melihat seluruh proses diagram alir HPLC :

         

Injeksi sample seluruhnya otomatis dan anda tidak akan mengharapkan bagaimana mengetahui apa yang terjadi pada tingkat dasar. Karena proses ini meliputi tekanan, tidak sama halnya dengan kromatografi gas (jika anda telah mempelajarinya).
Waktu retensi Waktu yang dibutuhkan oleh senyawa untuk bergerak melalui kolom menuju detektor disebut sebagai waktu retensi. Waktu retensi diukur berdasarkan waktu dimana sampel diinjeksikan sampai sampel menunjukkan ketinggian puncak yang maksimum dari senyawa itu. Senyawa-senyawa yang berbeda memiliki waktu retensi yang berbeda. Untuk beberapa senyawa, waktu retensi akan sangat bervariasi dan bergantung pada:

a.       tekanan yang digunakan (karena itu akan berpengaruh pada laju alir dari pelarut)

b.       kondisi dari fase diam (tidak hanya terbuat dari material apa, tetapi juga pada ukuran partikel)

c.        komposisi yang tepat dari pelarut

d.       temperatur pada kolom

Detektor

Ada beberapa cara untuk mendeteksi substansi yang telah melewati kolom. Metode umum yang mudah dipakai untuk menjelaskan yaitu penggunaan serapan ultra-violet.Banyak senyawa-senyawa organik menyerap sinar UV dari beberapa panjang gelombang. Jika anda menyinarkan sinar UV pada larutan yang keluar melalui kolom dan sebuah detektor pada sisi yang berlawanan, anda akan mendapatkan pembacaan langsung berapa besar sinar yang diserap.

Jumlah cahaya yang diserap akan bergantung pada jumlah senyawa tertentu yang melewati melalui berkas pada waktu itu. Anda akan heran mengapa pelarut yang digunakan tidak mengabsorbsi sinar UV. Pelarut menyerapnya! Tetapi berbeda, senyawa-senyawa akan menyerap dengan sangat kuat bagian-bagian yang berbeda dari specktrum UV.  Misalnya, metanol, menyerap pada panjang gelombang dibawah 205 nm dan air pada gelombang dibawah 190 nm. Jika anda menggunakan campuran metanol-air sebagai pelarut, anda sebaiknya menggunakan panjang gelombang yang lebih besar dari 205 nm untuk mencegah pembacaan yang salah dari pelarut.

Interpretasi output dari detektor

Output akan direkam sebagai rangkaian puncak-puncak, dimana masing-masing puncak mewakili satu senyawa dalam campuran yang melalui detektor dan menerap sinar UV. Sepanjang anda mengontrol kondisi kolom, anda dapat menggunakan waktu retensi untuk membantu mengidentifikasi senyawa yang diperoleh, tentunya, anda (atau orang lain) sudah mengukur senyawa-senyawa murninya dari berbagai senyawa pada kondisi yang sama. Anda juga dapat menggunakan puncak sebagai jalan untuk mengukur kuanti?tas dari senyawa yang dihasilkan. Mari beranggapan bahwa tertarik dalam senyawa tertentu, X.

Jika anda menginjeksi suatu larutan yang mengandung senyawa murni X yang telah diketahui jumlahnya pada instrumen, anda tidak hanya dapat merekam waktu retensi dari senyawa tersebut, tetapi anda juga dapat menghubungkan jumlah dari senyawa X dengan puncak dari senyawa yang dihasilkan.Area yang berada dibawah puncak sebanding dengan jumlah X yang melalui detektor, dan area ini dapat dihitung secara otomatis melalui layar komputer. Area dihitung sebagai bagian yang berwarna hijau dalam gambar (sangat sederhana). High-performance liquid chromatography ( HPLC) adalah suatu format kolom chromatography yang sering digunakan di ilmu kimia organik dan biokimia.

HPLC digunakan untuk memisahkan komponen dari suatu campuran menggunakan berbagai interaksi kimia antara unsur yang sedang dianalisa dan chromatography column. RP-HPLC bekerja dengan prinsip hydrophobic interaksi yang diakibatkan oleh kakas tolak antara suatu bahan pelarut non-polar, analyte non-polar, dan fase keseimbangan non-polar. HPLC, yang dalam bahasa Indonesia berarti ‘Kromatografi Cair Kinerja Tinggi’ memiliki fasa gerak cair dan fasa diam cair amupun padat.

Laju aliran fasa gerak pada HPLC ini dipercepat dengan pompa bertekanan tinggi. Sebelum 1970′s, hanya sedikit chromatographic yang di pakai oleh masyarakat umum, hanya tersedia untuk ilmuwan laboratorium. Selama 1970, kebanyakan separasi kimia dilaksanakan menggunakan berbagai teknik mencakup open-column chromatography, kertas chromatography, dan thin-layer chromatography. Bagaimanapun, kromatografi ini tidak cukup untuk hitungan resolusi dan campuran antara campuran yang serupa. Selama waktu ini, cairan tekanan chromatography mulai untuk digunakan untuk mengurangi flowthrough waktu, kemudian mengurangi pemurnian jam campuran yang sedang terisolasi oleh kolom chromatogaphy.    Bagaimanapun, laju alir tidaklah konstant, dan pertanyaan apakah menjadi lebih baik untuk mempunyai tekanan tetap atau laju alir tetap diperdebatkan. (Analytical Chem. vol 62, no. 19, oct 1 1990). Sekarang ini, orang mempunyai pilihan dalam mempertimbangkan jenis kolom untuk pemisahan campuran, seperti halnya berbagai detektor untuk menghubungkan dengan HPLC dalam rangka mendapatkan analisa optimal (menyangkut) campuran itu. Kita berharap tinjauan ulang ini akan menyediakan suatu acuan semua tingkat HPLC para pemakai yang akan mampu menemukan jawab cepat mengenai permasalahan permasalahan HPLC. Walaupun HPLC secara luas dianggap sebagai suatu teknik utama untuk biotechnological, biomedical, dan riset biokimia seperti halnya untuk industri yang berkenaan dengan farmasi, bidang ini saat ini berisikan hanya sekitar 50% Hplc Users..(Analytical Chem. vol 62, no. 19, oct 1 1990). Sekarang Ini HPLC digunakan oleh berbagai bidang yang mencakup kosmetik, energi, makanan, dan industri.

BAB II

PROSEDUR KERJA

2.1       Alat dan bahan

a.       Alat yang digunakan

1.      Wadah fase gerak

2.      Pompa

3.      Unit injeksi

4.      Kolom

5.      Detektor

b.      Bahan yang digunakan

1.      Paramex

2.      Paracetamol

3.      Panadol

2.2       Prosedur kerja

1.      Paracetamol (sampel) digerus sampai halus dengan menggunakan alat penggerus.

2.      Paracetamol yang sudah halus ditimbang sebanyak 500,1 mgr

3.      Sampel yang sudah halus dilarutkan dengan air panas sebanyak 250 ml lalu di aduk hingga homogeny

4.      Larutan tersebut disaring dengan menggunakan kertas saring

5.      Larutan tersebut dipipet dari aquator sebanyak 10 ml

6.      Kemudian larutan yang sudah disaring tersebut dimasukkan kedalam labu ukur 50 ml

7.      Kemudian dipipet FG CH₃COOH 60 % sampai batas

8.      Larutan tersebut siap untuk diinjeksikan kedalam alat HPLC.

  

BAB   III

GAMBAR RANGKAIAN

3.1              Gambar Peralatan

Satu set peralatan HPLC

 

             

            Pipet tetes                         Pipet volum                        Gelas ukur

Beaker glass

3.2              Gambar Rangkaian

3.3        Keterangan Gambar Rangkaian

Wadah Fase gerak dan Fase gerak

   Wadah fase gerak harus bersih dan lembam (inert).Wadah pelarut kosong ataupun labu laboratorium dapat digunakan sebagai wadah fase gerak.Wadah ini biasanya dapat menampung fase gerak antara 1 sampai 2 liter pelarut.Fase gerak atau eluen biasanya terdiri atas campuran pelarut yang dapat bercampur yang secara keseluruhan berperan dalam daya elusi dan resolusi.

Pompa
   Pompa yang cocok digunakan untuk HPLC adalah pompa yang mempunyai syarat sebagaimana syarat wadah pelarut yakni: pompa harus inert terhadap fase gerak. Bahan yang umum dipakai untuk pompa adalah gelas, baja tahan karat, Teflon, dan batu nilam.Pompa yang digunakan sebaiknya mampu memberikan tekanan sampai 5000 psi dan mampu mengalirkan fase gerak dengan kecepatan alir 3 mL/menit.

Tempat penyuntikan sampel

   Sampel-sampel cair dan larutan disuntikkan secara langsung ke dalam fase gerak yang mengalir di bawah tekanan menuju kolom menggunakan alat penyuntik yang terbuat dari tembaga tahan karat dan katup teflon yang dilengkapi dengan keluk sampel (sample loop) internal atau eksternal.

Kolom dan Fase diam

   Ada 2 jenis kolom pada HPLC yaitu kolom konvensional dan kolom mikrobor. Kolom merupakan bagian HPLC yang mana terdapat fase diam untuk berlangsungnya proses pemisahan solut/analit.

Detektor HPLC

   Detektor pada HPLC dikelompokkan menjadi 2 golongan yaitu: detektor universal (yang mampu mendeteksi zat secara umum, tidak bersifat spesifik, dan tidak bersifat selektif) seperti detektor indeks bias dan detektor spektrometri massa; dan golongan detektor yang spesifik yang hanya akan mendeteksi analit secara spesifik dan selektif, seperti detektor UV-Vis, detector fluoresensi, dan elektrokimia. 

BAB IV

DATA PENGAMATAN

4.1       Data Pengamatan

Data pengamatan pada Paracetamol :

1.      Peak A  :   tA        =   1,5 cm        =  15 mm         =  6 menit

                        tm        =   1  cm          =  10 mm         =  4 menit

                        WA     =   1,25cm       =  12,5 mm      =  5 menit

                        WH     =   1,3 cm        =  13 mm         =  5,2 menit

2.      Peak B  :    tB        =   1,45 cm      =  14,5 mm      =  5,8 menit

                        tm        =   0,9 cm        =   9 mm          =  3,6 menit

                        WB      =   1 cm           =  10 mm         =  4 menit

                        WH     =   1,6 cm        =  16 mm         =  6,4 menit

3.      Peak C  :    tC        =  1,5 cm         =  15 mm         =  6 menit

                        tM       =  1 cm            =  10 mm         =  4 menit

                        WC      =  1,2 cm         =  12 mm         =  4,8 menit

                         WH    =  1,5 cm         =  15 mm         =  6 menit

 BAB  VI

KESIMPULAN DAN SARAN

6.1       Kesimpulan

            Adapun kesimpulan yang dapat diambil dari percobaan ini adalah

1.      Sampel yang dianalisa pada percobaan kali ini adalah paracetamol, dimana yang dianalisa adalaha analisa ETDH.

2.      Semakin besar luas area sampel maka semakin besar pula konsentrasinya.

3.      Besar konsentrasi sampel yang dianalisa pada percobaan kali ini adalah 10 ppm, 20 ppm, dan 30 ppm.

6.2       Saran

1.      Dalam praktikum praktikan harus bekerja dengan teliti agar hasil yang diinginkan sesuai yang diharapkan

2.      Sebelum menghidupkan alat HPLC sebaiknya alat dikalibrasi terlebih dahulu

DAFTAR PUSTAKA

Barul, Adil. 2011. Diktat Kimia Analisa Instrument, PTKI Medan

Ratmayani, K. 2008. Penentuan Kadar Glukosa Dan Fruktosa Pada Madu Randu Dan Madu Kelengkeng Dengan Metode Kromatografi Cair Kinerja Tinggi. Universitas Udayana : Bukit Jimbaran.

http://www.chem-is-try.org/artikel_kimia/kimia_analis hplc/.

http://www.chem-is-try.org/materi_kimia/kimia_dasar/pemurnian-material/kromatografi/